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PCR實驗介紹

實驗步驟

1、 樣本總RNA提取（Trizol法）

1. 取適量待測樣本加入液氮后研磨粉碎；

2. 用1ml Trizol將研磨樣本轉移到取到1.5ml EP管中；

3. 向1.5ml EP管中加入500ul酚氯，仿振蕩混勻后，靜止5分鐘；

4. 4℃ 12000rpm離心10分鐘，小心吸取上清于一新的1.5ml EP管中；

5. 向分離出的上清中加入700ul異丙醇，充分混勻；

6. 4℃ 12000rpm離心10分鐘，小心棄上清；

7. 用75%乙醇洗滌沉淀一次，室溫晾干；

8. 50ul DEPC水溶解RNA沉淀；

9. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2、總RNA質量檢測

使用核酸濃度測定儀測定RNA濃度和純度，測量前先用溶解RNA用的DEPC水調零，操作方法如下：

1.  抬起樣品臂，把樣品加到檢測基座上；

2.  放下樣本臂，使用電腦上的軟件開始吸光值檢測。在上下兩個光纖之間會自動拉出一個樣品柱，然后進行檢測；

3. 當檢測完成后，抬起樣品臂，并用干凈的無塵紙把上下基座上的樣品擦拭干凈。

濃度測定

260nm處讀值為1表示40 ng RNA/μl。樣品RNA濃度計算公式為：A260 X 40 ng/μl。

純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值是一種RNA純度檢測方法，比值范圍1.8到2.1。即使比值超出這個范圍，RNA樣品也一樣可以用于一些普通實驗中如Northern雜交，RT-PCR和RNA酶保護實驗。

3、逆轉錄合成cDNA

逆轉錄使用invitrogen的逆轉錄試劑盒superscript III

1. 反應體系1建立：

2. 混勻，離心。65℃，5分鐘，結束后置于冰上。

3. 反應體系2建立：

4. 混勻，離心。置于42℃，水浴60分鐘。

5. 取出后置于85℃，反應10分鐘，滅活逆轉錄酶。

6. 反應結束后將產物置于-20℃待用。

4、實時熒光定量檢測

1. Real time PCR反應體系建立：

2. 體系混勻后，瞬離一下，置于熒光定量PCR儀上，按照以下條件反應：

3. Realtime PCR反應條件

結果示例：

合作流程：

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